Sinh ngày 26/11/1832 tại Oswego, New York, Mary Walker đã được hưởng một nền giáo dục sớm tại Học viện Falley ở Fulton, New York. Theo đuổi lĩnh vực vốn có truyền thống dành cho nam giới, bà ghi danh tại trường Cao đẳng Y khoa Syracuse và tốt nghiệp với tấm bằng Tiến sĩ vào năm 1855. Sau đó, bà chuyển đến Columbus, Ohio và bắt đầu công việc một cách độc lập. Quay trở lại quê nhà không lâu sau đó, Walker kết hôn với bác sĩ Albert Miller rồi hai vợ chồng chuyển đến New York sinh sống.
Chân dung bác sĩ Mary Walker.Khi cuộc nội chiến ở nước Mỹ diễn ra vào năm 1861, Mary Walker đã tình nguyện ra chiến trường làm công việc của một y tá. Đầu tiên, bà làm việc tại bệnh viện Patent Office ở thủ đô Washington. Sau đó, Mary Walker đã ngừng công việc tình nguyện viên này vào năm 1862 để tiếp tục học và lấy bằng từ trường New York Hygeio - Therapeutic College tại thành phố New York, rồi nhanh chóng quay trở lại phục vụ chiến tranh. Lần này, bà làm việc trực tiếp trên chiến trường, trong các căn lều dã chiến ở Warrenton và Fredericksburg, Virginia. Vào mùa thu năm 1863, Walker đến Tennessee và được bổ nhiệm làm trợ lý bác sĩ phẫu thuật trong quân đội Cumberland của tướng George H. Thomas, một trong những chỉ huy chính của cuộc nội chiến.
Tháng 4/1864, Mary Walker bị quân đội miền Nam bắt và giam giữ tại Virginia trong vài tháng. Tháng 8/1864, sau khi được thả, Walker quay trở lại thủ đô Washington và được nhận vào làm việc với vai trò là một trợ lý bác sĩ phẫu thuật ở tiểu doàn 52 bộ binh Hoa Kỳ. Sau đó, bà trở thành người quản lý của một bệnh viện dành cho các tù nhân nữ, tiếp đó là một trại trẻ mồ côi.
Mary Walker nghỉ hưu vào tháng 6/1865. Cuối năm đó, để ghi nhận những nỗ lực của bà trong cuộc chiến, Mary Walker đã được Tổng thống Mỹ trao tặng Huân chương Danh dự. Bà trở thành người phụ nữ đầu tiên được nhận Huân chương cao quý này.
Sau cuộc nội chiến, Walker đã trở thành diễn giả với những buổi nói chuyện về các vấn đề như cải cách trang phục và quyền bầu cử của phụ nữ...
Tuy vậy, đến năm 1917, chính phủ Hoa Kỳ đã thay đổi các tiêu chí dành cho Huân chương Danh dự, vì vậy Walker bị rút lại huân chương này. Bà qua đời hai năm sau, vào ngày 21/ 2/1919 tại Oswego, New York. Gần 60 năm sau cái chết của bà, năm 1977, Huân chương Danh dự của Mary Walker đã được Tổng thống Jimmy Carter khôi phục lại. Cho đến nay, Mary Walker vẫn là người phụ nữ duy nhất nhận được Huân chương Danh dự của nước Mỹ.